1840年4月7日，马相伯出生在江苏丹阳北乡马家村。也是在这一天，英国议会投票通过了女王政府对中国发动侵略战争的决议。马相伯父亲马松岩行医为业，他和妻子沈氏都是虔诚的基督徒。马相伯出生一个月后，即被抱到丹徒（即镇江）教堂接受了洗礼，并取教名为若瑟(Joseph)。
马相伯出生后，马家举家移居镇江。不久，鸦片战争爆发。1842年6月，英军进犯吴淞口，侵占上海，又溯江而上攻镇江。城里市民纷纷逃难，马松岩夫妻拖着儿女，逃回丹阳马家村避难。两岁的马相伯刚到老家就发高热，出现抽搐、昏迷。发热第三天开始出疹：他染上了天花。
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